Nowoczesna diagnostyka grzybicy skóry i paznokci.

5

Nowoczesna diagnostyka grzybicy skóry i paznokci

Grzybica jest jedną z najczęściej występujących chorób zakaźnych ludzi w Polsce i na świecie. Szacuje się, że nawet 20 % populacji cierpi z powodu infekcji wywołanych grzybami. Chorobę tę  powodują chorobotwórcze gatunki grzybów, ale w warunkach obniżonej odporności mogą wywołać ją również grzyby wchodzące w skład naturalnej flory mikrobiologicznej człowieka. Bardzo częstym i powszechnym problemem epidemiologicznym, terapeutycznym oraz społecznym są grzybice powierzchowne, czyli grzybice skóry i paznokci. 

Rezerwuarem patogennych dla człowieka grzybów są przede wszystkim inni ludzie, którzy przenoszą grzyby antropofilne,  zwierzęta przenoszące gatunki zoofilne, a w niektórych przypadkach również gleba (grzyby geofilne). Infekcje grzybicze rozprzestrzeniają się przez bezpośredni kontakt z osobą zakażoną oraz poprzez styczność ze skażonymi powierzchniami.  Szczególnie narażone są osoby korzystające z publicznych basenów, siłowni czy saun.

Infekcje grzybicze skóry i paznokci u ludzi wywoływane są przez trzy grupy grzybów wyodrębnione dla celów praktyki klinicznej. Są to: dermatofity z rodzajów Trichophyton, Microsporum i Epidermophyton, grzyby drożdżopodobne z rodzaju Candida oraz grzyby pleśniowe, które najrzadziej wywołują grzybicę.

Grzybica właściwa stóp i dłoni

Grzybica stóp należy do najczęstszych zakażeń grzybiczych człowieka, a grzybica skóry rąk niemal zawsze jest wtórna do grzybicy stóp. Wywołują je grzyby nazywane dermatofitami, które do wzrostu wymagają obecności keratyny – białka znajdującego się w skórze, paznokciach i włosach. Mechanizm działania dermatofitów polega na wydzielaniu enzymów keratynaz, rozkładających keratynę, co umożliwia grzybom zasiedlenie i bytowanie na powierzchni naskórka, paznokci czy włosów. Grzybicę stóp i dłoni w większości przypadków wywołują trzy gatunki antropofilnych dermatofitów: Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes i Epidermophyton floccosum. W zależności od postaci, jaką przyjmie grzybica może objawiać się zmianami złuszczająco-rumieniowymi pomiędzy palcami, drobnymi pęcherzykami, a także zmianami pokrytymi drobną łuską zlokalizowaną na podeszwach stóp. Zmianom tym towarzyszy również świąd.

Grzybica paznokci

Grzybica paznokci jest wywoływana w około 90% przez Trichophyton rubrum i Trichophyton mentagrophytes, rzadziej przez Candida albicans lub grzyby pleśniowe. W każdym przypadku zakażenia dochodzi do zmiany zabarwienia oraz struktury płytki paznokciowej. Zainfekowana płytka staje się białawożółtawa i krucha. Leczenie grzybicy paznokci i skóry opiera się na stosowaniu miejscowych preparatów przeciwgrzybiczych, a w cięższych postaciach i w przypadku nieskuteczności preparatów miejscowych konieczne jest leczenie ogólne. Z badań klinicznych wynika, że najskuteczniejszą metodą jest leczenie skojarzone, opierające się na połączeniu preparatu doustnego i miejscowego. Leczenie grzybicy często jest długotrwałe i może trwać  wiele tygodni, a nawet miesięcy. Z tego powodu zaleca się jak najszybszą diagnostykę, w celu niezwłocznego rozpoczęcia odpowiedniej terapii.

Diagnostyka zakażeń grzybiczych metodami klasycznymi i alternatywnymi

W każdym przypadku podejrzenia infekcji grzybiczej należy wykonać badanie mykologiczne, ponieważ sam obraz kliniczny nie jest wystarczający do rozpoznania grzybicy i rozpoczęcia leczenia. Wstępną diagnozę należy potwierdzić przez wykrycie obecności patogennego grzyba w zmienionych chorobowo paznokciach, czy na powierzchni skóry. W tym celu pobierany jest materiał biologiczny w postaci zeskrobin z paznokcia lub fragmentu łuszczącego się naskórka.

Podstawę diagnostyki mykologicznej stanowi niezmiennie badanie mikroskopowe, które bardzo często nie daje możliwości identyfikacji gatunku grzyba. Związane jest to z występowaniem zmian morfologicznych (zmian w strukturze komórek) w obrębie danego szczepu.

Uzupełniająca technika hodowlana napotyka z kolei problemy związane z subiektywną oceną wyhodowanych kultur oraz uzyskaniem negatywnego wyniku hodowli pomimo widocznych komórek grzyba pod mikroskopem. Diagnostyka ta jest również czasochłonna. Od momentu pobrania materiału do etapu wyhodowania kolonii może upłynąć nawet 8 tygodni.

Coraz częściej stosowaną metodą identyfikacji czynników chorobotwórczych są metody molekularne, w tym metoda łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR). Wyniki wielu badań wskazują, że bezpośrednia identyfikacja grzybów metodami molekularnymi jest o wiele bardziej wiarygodna i znacznie szybsza (ok. 5 dni) w porównaniu z prowadzoną metodami klasycznymi.

Zaletą metody qPCR jest niewątpliwie wysoka czułość (ok. 96,6-99%). Identyfikacja czynnika zakaźnego jest możliwa w większości przypadków, w których uzyskano negatywne wyniki hodowli grzybów. Metoda qPCR umożliwia identyfikację gatunku patogenu, co ma szczególne znaczenie, gdy stosowane dotąd leczenie nie przyniosło oczekiwanych rezultatów.

W przypadku badań klasycznych na diagnostykę ma również wpływ stosowanie przez pacjentów preparatów przeciwgrzybiczych. W celu wykonania badania należy zaprzestać stosowania takich preparatów na okres kilku tygodni, a nawet miesięcy przed pobraniem próbki. Stosowanie tych środków zakłóca rozwój dermatofitów (powoduje uszkodzenie błony komórkowej oraz zaburzenia metabolizmu komórkowego) w związku z czym ich wyhodowanie może być niemożliwe, pomimo że są one obecne w badanym materiale. W przypadku PCR patogen nie musi być żywy wystarczy, że w próbce znajduje się jego DNA. Pacjent nie musi zaprzestawać leczenia, co skutkowałoby dalszym rozwojem zakażenia.

Niewątpliwą zaletą metody PCR w czasie rzeczywistym jest automatyzacja interpretacji uzyskiwanych wyników.

Na czym polega reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR)

Materiał biologiczny wymaga odpowiedniej obróbki do analizy.  Próbkę materiału biologicznego poddaje się izolacji oznacza to, że DNA człowieka i ewentualnego patogenu zostają uwolnione z komórki gospodarza. DNA uwalniane jest w postaci kompleksu (połączone jest z białkami). Takie DNA musi zostać oczyszczone, ponieważ obecność innych struktur działa jako inhibitor kolejnych etapów reakcji (blokuje prawidłowy przebieg powielania i detekcji). W wyniku przeprowadzonego procesu otrzymuje się próbkę wtórną, która stanowi matrycę dla powielanego specyficznego fragmentu. Matrycowe DNA przenoszone jest do specjalnej mieszaniny, w skład której wchodzi: bufor, nukleotydy, startery (krótkie fragmenty DNA specyficzne dla każdego z diagnozowanych dermatofitów) i znakowane fluorochromami sondy (czyli cząsteczki, które emitują światło). Proces amplifikacji (powielania) przebiega w obecności enzymów katalizujących reakcję (polimeraza) i prowadzony jest w zaprogramowanych blokach grzewczych – termocyklerach.

Cykliczne zmiany temperatury bloku powodują kolejno: rozplecenie helisy DNA matrycy (denaturacja), przyłączenie starterów (hybrydyzacja), dodawanie pojedynczych nukleotydów powodujące wydłużanie nici DNA (elongacja). Cykle grzania i chłodzenia powtarzane są wielokrotnie, do momentu uzyskania odpowiednio dużej ilości powielonego DNA.

Przyrost materiału genetycznego obserwowany jest w czasie rzeczywistym poprzez rejestrację światła pochodzącego z barwników sond (w postaci krzywej amplifikacji). Wzrost krzywej dla analizowanego dermatofitu równoznaczny jest z otrzymaniem wyniku pozytywnego. W przypadku braku sygnału otrzymujemy wynik negatywny.

Identyfikacja gatunkowa grzybów oparta na wykrywaniu DNA patogenu jest bardziej wiarygodnym kryterium diagnostycznym od identyfikacji opartej na morfologii hodowli i struktur grzybni. Daje pacjentom możliwość szybkiego oraz prawidłowego zdiagnozowania, a co za tym idzie, wprowadzenia odpowiedniego leczenia.

Autorzy:

mgr Agata Migdal Diagnosta laboratoryjny

mgr Anna Łuka Koordynator ds. jakości badań

Molekularne laboratorium diagnostyczne Tomorrow labs

https://tomorrowlabs.pl/
https://www.facebook.com/laboratoriumtmrw